实验DIY：慢病毒包装简介及步骤

随着 基因编辑领域研究越来越普遍， 慢病毒的包装成为实验时常规实验之一。下面小编就介绍一下慢病毒包装实验方案，供大家参考。

1慢病毒包装系统简介

慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。目前被广泛地应用于表达RNAi的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，通常体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是3~5天，因而使其应用受到较大的限制。

然而，通过包装的慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

2慢病毒包装原理

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装shRNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

3慢病毒包装过程

(一)

准备阶段

1.构建含有目的基因的病毒载体。

2.指数生长的293T细胞；

3.病毒包装质粒Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2，不同载体系统所用的包装病毒质粒也不一样，此系统可用于包装PLKO，Plv等载体质粒。

4.转染试剂：lipo2000。

（二）

实验步骤

1.细胞分盘:通过胰酶消化收集细胞，将细胞种于60mm培养皿（根据实验需求）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的50％以上时进行转染。

2.混匀核心质粒和包装质粒:取两个无菌1.5ml EP管，一个EP管中加入200µl无血清DMEM，加入1.5µg核心质粒和1.5µg病毒包装质粒；另一个EP管中加入200µl无血清DMEM，加入6µl lipo2000，静止5分钟。然后将两管充分混匀，静置15-20min。

3.孵育:将这400μl的混合液逐滴加入细胞培养皿中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO2的37℃温箱孵育。

4.换液：10h-16h后吸去培养基，加入适量37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育。

5.收集病毒上清:转染后24h、48h左右收集含慢病毒的上清。1500rpm离心五分钟，或者使用0.45um滤器过滤后分装冻存于-80℃。避免反复冻融。

6.病毒感染:将细胞平铺于35mm培养皿，12-24h后换液，最佳密度为30%－50％。加入收集的病毒上清液培养。细胞长满后传代或者检测表达。

4慢病毒载体应用

1.将目的基因/RNAi基因转入难以转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；

2.进行稳转细胞株的筛选；

3.基因治疗；

4.药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用；

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